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实验九:血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

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实验九:血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.ppt
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实验九:醋酸纤维素薄膜电泳,一、实验目的,了解生物大分子的电泳分离原理了解电泳的基本操作方法,二、实验原理,电泳和电泳技术:混悬于溶液中的带电质点在外加电场作用下,向着与之带相异电荷的电极方向移动的现象叫做“电泳”。利用电泳现象来达到将多组分物质分离分析或分离制备的技术叫做电泳技术。 醋酸纤维素薄膜电泳:蛋白电泳支持介质的种类较多,如滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂糖等。蛋白质和氨基酸都是两性电解质,其分子中的羧基(—COOH)和氨基(—NH2)在溶液中均可解离。血清蛋白质的等电点均低于pH7.0,在pH8.6的缓冲液中带负电,向阳极移动,分子小且带电荷多者,则移动速度较快。,三 实验试剂,1、电泳缓冲液(PH=8.6,巴比妥酸-巴比妥钠缓冲液) 2、血清蛋白染色液(氨基黑试剂) 3、漂洗液(乙醇-醋酸溶液),醋酸纤维素薄膜电泳: 1、薄膜的准备:薄膜在毛面距短边1.5cm处用铅笔轻轻划一条点样线。浸入电泳缓冲液,充分浸泡,30分钟左右。(取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液,不可吸得过干) 2、电泳槽准备:电泳槽里加入缓冲液,用两张大滤纸的一端铺在电泳槽支架上,另一端浸入缓冲液。(滤纸桥)待滤纸吸饱缓冲液后,用玻璃棒轻轻擀走气泡,使粗滤纸紧贴在支架上。,四 、实验操作步骤,3、点样:用玻璃棒蘸取血清少量,在载玻片短边中央的一段轻轻涂布适量血清,均匀点压在纤维素薄膜加样线上,使血清渗透到薄膜内,形成均匀直线。 4、电泳:用镊子将薄膜加样的毛面向下搭在滤纸桥上,点样端在负极。薄膜与滤纸桥要垂直,中间不能下垂。电泳:100V,60min,从负极向正极移动。 5、染色:用镊子取出薄膜,置染色液中5分钟。(一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红,糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂,脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色),6、漂洗:在漂洗液中漂洗至背景蓝色退去,即可取出。吹干,观察。(对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5%醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定,可浸入冰醋酸:无水乙醇=30:70(V/V)的透明液中。) 五、实验结果 六、结果分析:1.点样量大小、均匀程度、点样位置、电泳时间、电泳电压、染色、脱色效果等方面分析。2.各电泳条带对应的血清蛋白。,
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