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实验六 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

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实验六 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳.ppt
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,醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质,实 验 目 的,通过本实验使学生掌握电泳的基本原理 学会薄膜电泳的基本操作 掌握血清中不同蛋白质的分离方法,,本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。 方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上,薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连,所用缓冲液pH值为8.6,血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷,在电场中向正极泳动。 由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快;带电荷少及分子量大者泳动速度慢,从而彼此分离。 电泳后,将薄膜取出,经染色和漂洗,薄膜上显示出五条蓝色区带,每条带代表一种蛋白质,按泳动快慢顺序,各区带分别为清蛋白、α1-球蛋白、 α2-球蛋白、 β-球蛋白和γ-球蛋白。 经洗脱比色观察不同蛋白质的区带。,实 验 原 理,,一、醋酸纤维素薄膜的润湿和选择 将2.0cm×8.0cm薄膜放入缓冲液中浸泡20min,整条薄膜颜色一致而无白色斑点,则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。 二、制作电桥 将巴比妥缓冲液(pH=8.6)倒入电泳槽内,两槽缓冲液平衡至同一水平面。两电极槽各放入两层滤纸,一端浸入缓冲液中,另一端贴附在电泳槽支架上,它们的作用是联系薄膜与两极缓冲液之间的中间“桥梁”。,操 作 方 法,,三、点样与电泳 取出浸透的薄膜,平放在滤纸上(无光面向上),轻轻吸去多余的缓冲液。用点样器蘸取血清,“印”在薄膜的点样区(如图示),点样区要呈粗细均匀一直线。将点好样的薄膜两端紧贴在电泳槽支架的滤纸桥上,无光泽面向下,点样端置负极,接通电源,电压160V,电泳25min。,,,,点样区,,,,,,6.5cm,,,1.5cm,四、染色与浸洗 电泳完毕后,切断电源,用镊子将薄膜取出,直接浸于氨基黑10B染色液中,10min后取出。再浸泡于漂洗液,反复漂洗,直至背景无色为止。,,五、结果判断 一般经漂洗后,薄膜上可呈现清晰的5条区带,由正极端起,依次为清蛋白、 α1-球蛋白、 α2-球蛋白、 β-球蛋白和γ-球蛋白。 六、透明 将薄膜用滤纸吸干或吹风机吹干,浸入透明液中,2min立即取出,紧贴:在载物片上,赶走气泡。完全干燥后,薄膜完全透明,可作扫描描或照相,将该玻璃板浸入水中,则透明的薄膜可脱下,吸干水分,可长期保存。,,清蛋白 α1球蛋白 α 2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白,pI4.88 5.06 5.06 5.12 6.85-7.3,泳动度(cm2/s.v) 5.9×10-5 5.14×10-5 4.1×10-5 2.8×10-5 1.0×10-5,分子量(kD) 69 200 300 90-150 156-300,,一、试剂 (1)新鲜血清(无溶血现象) (2)巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6)称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g,溶于少量蒸馏水后定容1000ml。 (3)染色液 称取氨基黑10B0.5g,加入蒸馏水40ml,甲醇50ml和冰醋酸10ml,混匀,贮存于试剂瓶中。 (4)漂洗液 取95%乙醇45ml,冰醋酸5ml和蒸馏水50ml,混匀。 (5)透明液 冰乙酸25ml,95%乙醇75ml混匀。 (6)洗脱液 0.4mol/L NaOH。 二、器材 电泳仪、电泳槽、乙酸纤维素薄膜、点样器、滤纸、剪刀、镊子、分光光度计,试 剂 和 器 材,,1、醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大,以防止薄膜干燥,电泳图谱出现条痕。 2、缓冲溶液离子强度不应小于0.05或大于0.07。因为过小可使区带拖尾,过大则使区带过于紧密。 3、电泳槽中缓冲液要保持清洁(数天过滤)两极溶液要交替使用;最好将连接正、负极的线路调换使用。 4、通电过程中,不准取出或放入薄膜。通电完毕后,应先断开电源后再取薄膜,以免触电。,注 意 事 项,
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